结构解析哪家强?

结构生物学是现代生命科学研究的前沿主流学科之一,对生物大分子结构与功能的深入研究不仅可以解决一系列重大的基础科学问题,帮助人们更好地理解生命现象本质,而且与人类健康息息相关,将极大地促进基于生物大分子结构的新药研究及开发。

施一公

目前常用的解析蛋白质结构的方法主要有X射线晶体衍射技术、核磁共振技术和冷冻电镜技术。

X射线晶体衍射技术

晶体向来以其规律性和对称性而备受推崇,直到17世纪才渐渐被科学地研究。1611年,约翰内斯·开普勒(Johannes Kepler)发现了雪花的对称六角结构。从1895年威廉·伦琴(Wilhelm Rntgen)发现X射线,到1912年单晶X射线衍射技术提出并开发,再到1958年肌红蛋白作为首个运用X射线晶体衍射技术解析出来的蛋白质结构,该技术已经成为解析蛋白质结构中最重要、最有力的工具。

结构解析哪家强?
图源: 阿里云

截止今天,PDB数据库中已录入的生物大分子结构将近17万个(数据获取于2020年10月10日),其中近90%的结构都来自于X射线晶体衍射技术,可见其功能的强大。晶体衍射技术可以解析出原子分辨率的结构,但是该方法的局限之处在于,样品必须是可结晶的。针对生物大分子,特别是膜蛋白和淀粉样蛋白质,溶解度低,难以结晶或者不可结晶,则需要考虑使用其他的技术进行结构解析。

核磁共振技术

自1946年首次观测到凝聚态核磁信号以来,NMR技术经历了70多年的飞速发展,其应用也逐渐扩展到化学、医学、材料科学和生命科学等领域。20世纪80年代,该技术开始应用于蛋白质结构解析,进一步促进了NMR技术在生命科学领域的应用。

目前,用于解析蛋白质结构的核磁共振技术主要分为液体核磁共振技术和固体核磁共振技术。两者研究的对象不同,简单来说,前者是以液体样品为研究对象,后者则是以固态样品为研究对象。

液体核磁共振解析生物大分子的结构时受限于其分子量,一般情况下常用来分析50 kDa以下的蛋白质。在一些特殊情况下,也可以用来解析100 kDa以上的膜蛋白。固体核磁共振技术,则不受限于样品的分子量大小,且针对淀粉样蛋白质纤维这种不结晶且不溶于水的样品,或者是磷脂环境下的膜蛋白(近天然环境中下的结构)以及其他生物大分子复合物,则优势明显,成为结构解析生物大分子结构的有力工具。

NMR不仅可以解析出原子分辨率水平的结构,同时还可以提供动力学以及分子间相互作用等重要信息。不过,该技术需要借助于2H,13C和15N同位素标记的样品,成本较高;同时,核磁数据的解析、谱图信号的归属也是一项复杂的工作,尤其是分子量大的生物大分子,核磁谱图复杂,也为后续的结构解析工作带来了挑战。

冷冻电镜技术

1968年科学家首次运用电子显微镜三维重建技术,重建了T4噬菌体(属于大肠杆菌T系噬菌体,为烈性噬菌体)尾部的三维结构。1974年低温电子显微镜技术得以提出并发展。经过30多年的发展,Cryo-EM已成为研究生物大分子结构的有力工具。

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显微镜下的大肠杆菌。图源: 维基百科

近年来,Cryo-EM技术取得了革命性的进展,特别是在单一粒子分析方面。自2013年以来,随着电子探测器和图像处理的巨大进步,Cryo-EM单粒子分析进展非常迅速,Cryo-EM的分辨率现在可与单晶 X 射线衍射相媲美。

目前,Cryo-EM正在成为解析生物大分子高分辨率结构的有力工具。该技术的优点主要体现在可以通过快速冷冻处理技术,保持样品的原生状态,不需要蛋白质结晶,仅用毫克级样品(约0.1毫克),即可获得高分辨率的结构。此外该技术对样品纯度的要求并不苛刻,对于某些难以通过表达纯化获得较高纯度的膜蛋白来说,非常友好。

目前Cryo-EM对生物大分子的结构测定,能够比较容易地获得大型复合物(300 kDa以上的蛋白质)在原子分辨率水平的结构。然而,针对200 kDa以下的蛋白质,因为其颗粒在冷冻样品中衬度不足,会导致很难获取其高分辨率的结构信息。

上文简述的三种方法,各有所长。其实,没有任何一种技术是万能的,我们在做科研的过程中必须要有全局意识,并在每一阶段及时权衡利弊。将传统技术与新技术进行优势互补,有机结合,不断以协作共赢的态度去寻求突破。

参考文献

  1. Comparison of Crystallography, NMR and EM, Date retrieved: 11 October 2020
  2. X-ray crystallography, Wikipedia, Date retrieved: 11 October 2020
  3. Protein Data Bank (PDB), Date retrieved: 11 October 2020
  4. 深入患者大脑,窥探最真实的淀粉样斑块, 科学你我他
  5. 新型X射线检测器,自给自足新选择, 科学你我他
  6. 迄今为止最厉害的显微镜,究竟能看到什么? 科学你我他

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