冷冻电镜——淀粉样纤维结构解析的利器

蛋白质折叠是多肽链获取三维结构并行使生物功能的关键,蛋白质的错误折叠现象与一系列人类疾病相关,包括阿尔茨海默症、帕金森病、II-型糖尿病以及系统性淀粉样变性。运用冷冻电镜技术,科学家能够揭示蛋白质错误折叠的机制以及患者的特异性突变在致病性研究中的作用。

蛋白质折叠 (protein folding) 是多肽链获取三维结构并行使生物功能的关键,然而有一些蛋白质却具有从天然功能状态转换为淀粉样聚集体状态的内在倾向,这种蛋白质的错误折叠 (protein misfolding) 现象与一系列人类疾病相关,包括阿尔茨海默症、帕金森病、II-型糖尿病以及系统性淀粉样变性。

系统性淀粉样变性 (systematic amyloidosis) 是由于蛋白质错误折叠形成的淀粉样蛋白质,在全身不同的器官和组织中沉积,破坏相应器官和细胞的正常生理功能而引发了一系列疾病。其中,单克隆免疫球蛋白轻链 (immunoglobulin light chain) 淀粉样变性 (AL amyloidosis) 是最常见的类型,也被称为原发性淀粉样变性 (primary amyloidosis)。当骨髓产生不能被分解的异常抗体时,该异常抗体作为淀粉样蛋白质沉积在组织中,干扰正常的生理功能,从而引发淀粉样变性,该淀粉样蛋白质主要影响心脏、肾脏、肝脏、神经系统和消化系统,其中聚集在心脏的淀粉样蛋白质是导致死亡的最危险因素。

冷冻电镜——淀粉样纤维结构解析的利器
系统性轻链淀粉样变性 (AL amyloidosis)。图源: Cleveland Clinic

目前对于致病性轻链淀粉样纤维的结构信息知之甚少,这也在很大程度上限制了关于其错误折叠机理以及后续病理学的研究。然而,随着显微镜成像的硬件技术和图像处理的自动化能力的发展,冷冻电镜 (低温电子显微镜,Cyro-EM) 正日益成为研究细胞、病毒和蛋白质结构的主流技术。利用冷冻电镜技术,科学家们可以在分子层面上分析保存在原始细胞环境中的淀粉样纤维的结构,进一步将淀粉样蛋白质的聚集与细胞毒性联系起来,分析蛋白质错误折叠的分子机理,从而为这一系列由于蛋白质错误折叠引起的人类疾病 (protein misfolding diseases) 带来新的线索。

最近,德国乌尔姆大学Marcus Fändrich课题组通过使用冷冻电镜技术,成功解析了系统性轻链淀粉样变性患者体内的轻链淀粉样纤维 (AL fibrils) 的分子结构,该分子结构的分辨率是3.3 Å。他们发现该淀粉样纤维的核心片段包括91个氨基酸残基,该片段呈现β折叠的结构,在其平行交叉的β折叠 (parallel cross-β sheets) 二级结构中,含有12条长度不一的β链 (β1- β12),而蛋白质的N-端和C-端则呈现出无规则的构型状态,同时以反平行的状态排列。与轻链蛋白质天然折叠状态的构象不同,该淀粉样纤维N-端和C-端的反平行构象是由于分子内二硫键周围的旋转开关导致的结构重排引起的。从形态学的角度,该淀粉样纤维是由一根原纤丝 (protofilament) 组成的,且纤维的横截面是不对称的。与其他淀粉样纤维相反的是,该淀粉样纤维中具有高聚集倾向的疏水片段暴露在水溶液环境中,而具有低聚集倾向的高酸性氨基酸片段反而被包裹在疏水区域核心中。

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免疫球蛋白轻链淀粉样纤维β-折叠结构。图源:《自然·通讯》

淀粉样纤维可以通过体外培养获得,但是由于脱离了最初的细胞环境,可能会导致体外培养的淀粉样纤维显示出不同的形态和分子结构。在该项研究中,为了获取原位的轻链淀粉样纤维AL fibrils的结构,Marcus Fändrich课题组从一位女性病人的心肌组织中提取了淀粉样纤维,进行相关的分析实验,获得了原子层面的三维结构。与此同时,他们深入分析了AL fibrils的结构信息,提出了该蛋白质发生错误折叠,形成淀粉样纤维的分子机理。从形态上看,相较于原生态 (native state) 蛋白质,纤维态蛋白质 (fibril state) 的结构更具延伸性且更加扁平;从三维结构上看,原生态蛋白质和纤维态蛋白质在二硫键周围存在着不同定位的结构重排。原生态蛋白质二硫键区域周围的结构重排导致N-端和C-端片段以平行的N到C的定位排列,而纤维态的蛋白质,则显示反平行的排列定位,因此,蛋白质的错误折叠导致N-端和C-端片段反平行地分列于二硫键的两侧。

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原生态和纤维态蛋白质比较。图源:《自然·通讯》

巧合的是,意大利米兰大学的Stefano Ricagno与Martino Bolognesi课题组几乎在同一时期,利用冷冻电镜技术,也报道了轻链淀粉样纤维的分子结构,该淀粉样纤维来自于一例患有严重的淀粉样心肌病患者心脏组织,结构的分辨率是4 Å。与Marcus Fändrich课题组提出的分子结构相似的是,该淀粉样纤维是由不对称的单一原纤丝组成的,且具有β折叠的结构。不同的是,每一根原纤丝是由9条长度不一的β链 (β1- β9) 组成,其中β1、β3、β5和β6链彼此面对,紧密地将它们的侧链包裹在一起,而β4、β7和β9链形成了第二接触区,该接触区侧链之间的相互作用较弱。此外,该项研究提出了轻链蛋白质聚集的最基础元件,就是从组织中提取出的含有77个氨基酸残基的两个不同的多肽片段,这两个不同的多肽片段,已符合聚集形成淀粉样纤维的基本条件。

上述两项研究成果运用冷冻电镜技术,解析得出了高分辨率的轻链淀粉样纤维的分子结构,揭示了蛋白质错误折叠的机制以及患者的特异性突变在致病性研究中的作用。该种以病人为导向,以不同器官沉积的淀粉样蛋白质聚集体为研究对象,从分子层面上直接揭示了蛋白质错误折叠的过程,获得了蛋白质的三维结构,一方面为后续基于该淀粉样纤维结构的药物小分子 (structure-based drug) 和临床诊断示踪剂的设计与开发提供了依据;另一方面,从蛋白质的错误折叠与淀粉样纤维的形成过程入手,为抑制蛋白质的聚集,清除淀粉样纤维的研究提供了新的思路。

参考文献:

  1. Cleveland Clinic.
  2. Radamaker L. et al, Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis, Nat. Comm. 2019, 10, 1103.
  3. Swuec P. et al, Cryo-EM structure of cardiac amyloid fibrils from an immunoglobulin light chain AL amyloidosis patient, Nat. Comm. 2019, 10, 1269.

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